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PCR仪种类有哪几种?
点击次数:343 发布时间:2018-07-30 打印本页面 返回

热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。热启动PCR主要借助一种酶的修饰物(如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物)来抑制常温下DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低,从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制,热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利,而无需牺牲PCR反应的特异性。

当反应体系配制好后,在反应初始加热步骤,酶修饰物在高温下(通常高于90 ℃)被释放,使得DNA聚合酶被激活(图1)。激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。对于某些聚合酶,激活和预变性合并成了一步。

DNA聚合酶
图1. 基于抗体热启动技术的DNA聚合酶

降落PCR(Touchdown PCR)
另一种提升PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR仪中,前几个循环的退火温度设定为比引物的高退火温度(Tm)再高几度[1,2]。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物与模板形成的复合物,因此可以减少不希望出现的扩增。就这一点来说,较高的退火温度可减少非特异性PCR产物,在PCR起始阶段促进特异性的扩增。

虽然较高的退火温度可阻止引物二聚体形成和非特异性引物结合,但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离,导致PCR的产量降低。为了克服这个问题,在开始的几个循环中,退火温度通常设置为每个循环降低1℃,以获得足量的预期扩增子。当退火温度降低到温度时(通常比低的引物Tm低3-5℃),剩余的循环都维持此退火温度。通过这种方法,在PCR过程中,所期望的PCR产物得到有选择性的增加,而几乎不会出现非特异性的产物(图2)。

PCR仪

图2. 降落PCR。通过以较高的温度起始,再随着循环逐渐降低到退火温度(黑色曲线),这种PCR方法可提升反应特异性(黄色曲线)。目标扩增子的产量(绿色曲线)相应的得到富集。

巢式PCR(Nested PCR)

巢式PCR是常规PCR的一种演变,其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中,需要设计两对引物:一对(外引物)在目标扩增区域的侧翼,而另一对引物(巢式引物)对应于所扩增DNA的准确区域。轮PCR的产物之后作为第二轮PCR的模板(图3)。图3. 巢式PCR

曹式PCR仪

如果对引物(外引物)由于引物错配扩增出了非特异性产物,第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,所以通过第二对引物的扩增,PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的另一个好处是这种方法有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。

快速PCR(Fast PCR)

在快速PCR中,通过缩减PCR步骤所需的时间来完成更快的扩增,而不影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于均有高扩增能力的DNA聚合酶,这种聚合酶在每次结合中可引入更多的核苷酸。高扩增能力的聚合酶可保持高扩增效率,而PCR延伸时间是Taq聚合酶(低扩增能力)延伸时间的1/2到1/3。通过将引物退火和延伸(如果温度仅相差几度)合并成一步,PCR反应时间可进一步缩短。这个方案也被称为两步PCR方案。
当使用低扩增能力的DNA聚合酶(如Taq酶)扩增<500>

另一种快速PCR的调整方法为缩短变性时间,将温度升高到98℃。使用这种策略需要注意的是,不是高度热稳定的聚合酶在如此高温下容易变性。
直接PCR(Direct PCR)
直接PCR意指直接从样本中扩增目的DNA,而无需核酸纯化。直接PCR中,在高温变性阶段,诸如细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解,释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程,减少了动手操作的时间,同时可避免纯化步骤中DNA的损失:常规PCR与直接PCR对比。

直接PCR仪 间接PCR仪

推荐具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中,它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂,从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度,因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA。

高GC含量PCR(GC-rich PCR)具有高GC含量(>65%)的模板由于G和C碱基间的强氢键影响,比较难以扩增。高GC含量序列同时也涉及二级结构。因此,高GC含量序列可使DNA聚合酶在扩增时卡住,从而影响了DNA的合成。

为了扩增高GC含量片段,双链模板必须分离,以便引物结合及DNA聚合酶读取序列。为了克服强GC相互作用,常用的方法是依靠PCR添加剂或共溶剂来帮助DNA变性,如DMSO。这些试剂通常会降低引物的Tm,所以退火温度也需做相应的调整。

高合成能力的DNA聚合酶由于其与模板的强结合能力,有助于高GC含量模板的PCR扩增。高热稳定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR扩增,因为更高的变性温度(如98℃代替95℃)可促进解链和PCR扩增。


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